1. 試劑與材料的準(zhǔn)備

二甲苯替代品

100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇

蒸餾水

PBS

蛋白酶消化液

變性液

洗液：2×SSC+0.1%NP-40

塑料玻片盒

Rubber Cement

蓋玻片

DAPI-抗熒光淬滅封片劑

 2. 實(shí)驗(yàn)步驟

⑴ 石蠟切片（標(biāo)本厚度約5μm）在烘箱中90℃1小時(shí)；

⑵ 浸入二甲苯替代品中，每缸5min；

⑶ 依次在100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中浸泡2min，

⑷ 將片子浸泡在蒸餾水中，煮30min；PBS浸泡，5min/次，2次

⑸ 將蛋白酶消化液預(yù)熱至37℃；

⑹ 把片子浸泡在蛋白酶K消化液中，37℃消化5～25min；（隔5min左右，取出片子，觀察消化情況）

⑺ PBS浸泡，5min/次，2次

⑻ 依次在70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中浸泡1min，空氣晾干；

⑼ 以下方法二選一：

玻片探針共變性

取10μl探針，滴加在標(biāo)本上，蓋上蓋玻片，Rubber Cement封住蓋玻片，雜交儀85℃變性8min；37-42℃雜交過(guò)夜。

玻片、探針?lè)珠_(kāi)變性

①將70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇放入-20℃冰箱中，預(yù)冷；

②變性液水浴到77℃后，將片浸泡在其中，77℃4～6min；取出片子，立即將片子浸入預(yù)冷70%乙醇，1min，在依次將片子浸入85%乙醇、70%乙醇中，各1min；室溫晾干（或用吹風(fēng)機(jī)吹干，備用）；

③探針加入到0.2ml離心管，放入PCR儀中，95℃變性3min，37℃平衡2min；取10μl探針滴加在標(biāo)本上，蓋上蓋玻片，Rubber Cement封片，42℃雜交，過(guò)夜；

⑽ 將一缸洗液預(yù)熱至42℃;揭去凝固的Rubber Cement，將片子浸泡在常溫的洗液中，待蓋玻片自動(dòng)脫落；再將片子放入72℃洗液中，5min；

⑾ 將片子移至常溫洗液，浸泡5min；

⑿ 70%乙醇、100%乙醇脫水，晾干；

⒀ 滴加10μl 的DAPI-抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，15min后觀察。

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