EB病毒原位雜交檢測試劑盒
一、試劑盒介紹:貨號:EB-1803
試劑1 |
玻片處理液A |
50毫升 |
試劑2 |
生物素標記的EB探針雜交液 |
5毫升 |
試劑3 |
HRP標記的抗生物素抗體溶液 |
5毫升 |
試劑4A |
DAB顯色液A液 |
0.5毫升 |
試劑4B |
DAB顯色液B液 |
0.5毫升 |
試劑5 |
蛋白酶K緩沖液 |
50毫升 |
試劑6 |
PBS緩沖液 |
1000毫升×2袋 |
試劑7 |
2xSSC緩沖液 |
1000毫升×4袋 |
試劑8 |
蘇木素染液 |
50毫升 |
(1)檢測原理:
EB病毒屬DNA類的皰疹科病毒,能特異性嗜淋巴細胞。通過接觸傳播,將侵入鼻咽部的淋巴樣組織或其他腫瘤組織內部。主要侵犯的是B淋巴細胞。EB病毒在自然界廣泛存在,與鼻咽癌發(fā)病密切相關、還腸道腫瘤以及傳染性單核細胞增多癥有關,此外還和淋巴瘤發(fā)病密切相關,如霍奇金淋巴瘤,Burkitt淋巴瘤等、慢性疲勞綜合征、器官移植等。
EBER是EB病毒編碼的小RNA,在EB病毒感染的細胞核內出現(xiàn)。對EBER進行克隆、合成標記的EBER RNA探針,可用于冰凍切片、石蠟切片、細胞涂片、細胞爬片,具有較高的特異性和靈敏度。
(2)試劑盒特點:
本試劑盒采用生物素標記探針,辣根過氧化物酶系統(tǒng)DAB顯色劑,敏感性強;蛋白酶K消化,穩(wěn)定可靠;37℃雜交即可;常溫PBS洗滌;一步檢測。
(3)試劑盒成份:
(4)保存條件
Ø 所有試劑2-6℃保存;
Ø 試劑盒在有效期內的穩(wěn)定;
Ø 不要使用已經過期的試劑;
Ø 用前,將所有的試劑恢復至室溫(20-25℃),探針溶液必須混勻;
Ø 應帶手套操作,使用新鮮二甲苯及乙醇溶液。
二、 檢測預準備
l DAB顯色液:將試劑4A:4B:PBS按體積比1:1:18的比例混合,按實際需要量配制,即配即用。
l PBS配制:將一袋PBS粉末溶于1000毫升雙蒸水,徹底溶解,混勻后使用。
l SSC緩沖液:將一袋SSC粉末溶于1000毫升雙蒸水,溶解,混勻后使用。
三、 檢測步驟
1. 烤片:將組織切片置于烤箱或加熱板,在85℃的溫度下加熱20分鐘。.
2. 脫蠟:把加熱后的組織切片浸泡在二甲苯溶液中,五分鐘一次,總計三次。再將組織切片依次放入梯度乙醇100%、85%和75%中,每次3分鐘。用蒸餾水洗滌2分鐘。
3. 再用,3%的雙氧水浸泡組織切片15-25分鐘,用蒸餾水洗滌2分鐘。
4. 在組織切片或細胞上滴加200-300μl 玻片處理液,在常溫下浸泡20分鐘,用PBS洗滌5分鐘。
5. 每一個載玻片上滴加200-300μl 蛋白酶K緩沖液,使之覆蓋細胞,放入濕盒中,在37℃的干燥箱中培養(yǎng)15分鐘,用PBS洗滌3次,每次5分鐘。
6. 每一個組織切片上滴加30-50μl的含有生物素標記的EB探針的雜交液,蓋上蓋玻片,在95℃的加熱板上加熱5min,再放入濕盒中,在37℃的干燥箱中放置至少16h。
7. 取出濕盒中的組織切片,用2xSSC溶液洗滌15 min。
8. 在組織切片中加入30-50μl/片的HRP標記的抗生物素抗體的溶液,常溫下孵育1小時,用2xSSC洗滌15分鐘。
9. 加適量配制好的DAB顯色液,顯色5-15分鐘,注意光鏡下觀察顯色情況。用蒸餾水沖洗1分鐘。
10. 滴加適量蘇木素復染,染色約1min,用蒸餾水或去離子水短時間沖洗,浸泡PBS 10分鐘返藍。
11. 封片:依次放入梯度乙醇溶液(75%、85%、100%)中各3min,再放入二甲苯溶液中,10分鐘。滴加中性樹脂,蓋蓋玻片,常溫保存。兩年內不褪色。
四、 結果評判:
(1)陽性結果出現(xiàn)在細胞核上,顏色顯示深棕色或淺棕色,與EB含量有關,陰性結果是核上無棕色。
(2)細胞漿,紅細胞染色是非特異的,因為部分血液細胞、紅細胞、內分泌細胞存在內源性酶或生物素。
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