原位雜交可以用于對培養(yǎng)細(xì)胞、水細(xì)菌、淤泥、糞便等，對細(xì)菌鑒定、細(xì)胞、計數(shù)，成為分子系統(tǒng)發(fā)育鑒別或基因表達(dá)分析的有力工具。然而，在液體中也可以對細(xì)胞、革蘭氏陽、陰性細(xì)菌、某些環(huán)境細(xì)菌樣品進(jìn)行均勻核酸雜交，然后進(jìn)行FISH、流式、顯微鏡觀察分析面。開展溶液原位雜交的檢測，在懸液中完成。在培養(yǎng)細(xì)胞、微生物中能區(qū)分多種細(xì)菌，包括芽孢桿菌，變形菌及分析細(xì)胞基因的表達(dá)。
試劑：抗熒光衰減試劑(含DAPI)、乙醇（50%，85%，95%、100%，冷存，固定）、FISH固定液、FISH雜交液、細(xì)菌培養(yǎng)基、標(biāo)記的核苷酸探針、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）（pH 7.4）、20XSSC（0.1X，pH 7.0）
設(shè)備：鋁箔、蓋玻片、離心機(jī)、移液器、吸頭、顯微鏡、熒光顯微鏡（適當(dāng)濾光片）、透明指甲油或抗熒光封片劑、分光光度計、培養(yǎng)管、微型離心管、水浴鍋或雜交儀。
培養(yǎng)的細(xì)胞
1.將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶，在指數(shù)最佳生長時候，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)觀察，將適當(dāng)細(xì)胞密度用于比較雜交。
2.丟棄上清液，并將細(xì)胞用胰蛋白酶消化完全重新懸浮在1 ml的pH 7.4的1X PBS中。
3.以3,000 g離心5 min，丟棄上清液。
4.在500 µl 1X PBS（pH 7.4）中重新懸浮細(xì)胞。
5.加500 µl冷100%乙醇，將試管儲存在−20°C。固定細(xì)胞可在−20°C下儲存數(shù)月。
6.雜交之前，3000g，5 min使細(xì)胞顆�；瘲壣锨逡�，去除殘留乙醇。
革蘭氏陽性細(xì)菌固定
1. 細(xì)菌培養(yǎng)物，接種2 ml肉湯培養(yǎng)物并在最佳生長溫度、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)后，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)（或OD600分光光度計讀數(shù)），以便將適當(dāng)細(xì)胞密度用于比較雜交。
2. 在對數(shù)生長期（OD600 0.4-1.0），以13,000 g離心5 min獲取細(xì)菌。在生長的對數(shù)期收集的細(xì)胞將提供較好的信號。如果需要，使用較大規(guī)模培養(yǎng)，但小規(guī)模的培養(yǎng)物也能為FISH提供足夠的細(xì)胞數(shù)量。
3.丟棄上清液，并將細(xì)胞完全重新懸浮在1 ml的pH 7.4的1X PBS中。
4.以13,000 g離心5 min，丟棄上清液。
5.在500 µl 1X PBS（pH 7.4）中重新懸浮細(xì)胞。
6.加500 µl冷100%乙醇，將試管儲存在−20°C。固定細(xì)胞可在−20°C下儲存數(shù)月。
7.雜交之前，以13,000g，5 min使細(xì)胞顆�；瘲壣锨逡�。從細(xì)胞顆粒中去除殘留乙醇。
革蘭氏陰性細(xì)菌固定
1.對于每個細(xì)菌培養(yǎng)物，接種2 ml肉湯培養(yǎng)物，在培養(yǎng)基中以最佳生長溫度培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)完成后，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)（或OD600分光光度計讀數(shù)），以合適細(xì)胞密度用于比較雜交。
2.將每種培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到2 ml微型離心管中，以13,000 g離心5 min。丟棄上清液。
3.在每管1 ml FISH用固定液中重新懸浮細(xì)胞顆粒，并在室溫下培養(yǎng)3 h。
4.以13,000g離心細(xì)胞混合物5 min并丟棄上清液。
5.通過50%乙醇重新懸浮并在室溫下孵育5 min，洗滌細(xì)菌。
6.以13,000 g離心試管2 min，丟棄上清液。
7.用80%和95%的乙醇重復(fù)步驟12-13。
8.通過吸引器或?qū)⒃嚬苤糜诳焖僬婵崭稍餀C(jī)中干燥細(xì)胞顆粒10 min。固定后可在4°C下儲存1個月。
環(huán)境樣品固定
對于環(huán)境樣品，有必要包括未與標(biāo)記探針孵育的樣品，以評估樣本的自發(fā)熒光。
1.盡可能使環(huán)境樣品均勻化，減少聚集對獲得探針可接近的單細(xì)胞懸浮液的不利影響。在雜交之前通過離心分離細(xì)胞或洗滌環(huán)境樣品。
2.根據(jù)目標(biāo)種群類別，對細(xì)菌固定方案。如果環(huán)境樣品很可能含有革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌的混合物，并且有必要與針對革蘭氏陰性和陽性細(xì)胞的探針雜交，那么在雜交之前，樣品可用兩次不同方法固定。
1.將固定細(xì)胞重新懸浮在500 µl FISH雜交溶液中，在37°C下培養(yǎng)30 min。完成后移除一份預(yù)雜交混合物的子樣本（如50 µl）進(jìn)行雜交。每個樣品都能進(jìn)行多次雜交，減少每個反應(yīng)所需的探針。
2.混合物中加入熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針。
探針濃度應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗決定。幾個因素可影響所需探針數(shù)量：探針靈敏度、樣品密度和雜交時間。根據(jù)經(jīng)驗，將5 µl 100 ng/µl探針加到50 µl預(yù)雜交液,中可產(chǎn)生一致且均勻的熒光。
3.在37°C至65°C避光處雜交或用鋁箔覆蓋試管孵育2-3 h。如使用多個探針，建議65℃下進(jìn)行雜交。根據(jù)所用探針和樣品性質(zhì)。根據(jù)經(jīng)驗42°C，改變甲酰胺濃度，可以達(dá)到所需的雜交效果。
4.以13,000 g離心混合物5 min并丟棄上清液。
5.通過在20 µl 0.1X SSC中重新懸浮細(xì)胞顆粒以清洗細(xì)胞，并在37°C的黑暗中培養(yǎng)15 min。
6.以13,000 g離心混合物5 min并丟棄上清液。
7.重復(fù)步驟22-23兩次。
8.在20 µl 0.1X SSC中重新懸浮洗滌過的細(xì)胞顆粒。
9.在載玻片上制備樣品：
i. 將10 µl樣品轉(zhuǎn)移到用乙醇清洗過的顯微鏡載玻片上。
iv. 儲存載玻片于黑暗中。在觀察前可在4°C的黑暗中保存至多1 周。
10.通過流式檢測，選擇正確的流式光源通道。
實(shí)驗問題：
1. 雜交溫度：更低的溫度會導(dǎo)致探針雜交增加，但也會降低特異性。
2.去離子甲酰胺濃度：可能需要低濃度的甲酰胺。一般情況下，0%-40%的甲酰胺尋找合適的范圍濃度。
3.探針濃度：根據(jù)給定探針對靶區(qū)的可達(dá)性，可能需要更多的探針進(jìn)行充分雜交。
4.洗滌步驟中使用的SSC濃度：使用1X SSC代替0.1X SSC將降低洗滌步驟的嚴(yán)密性。
5.洗滌溫度：37°C通常被認(rèn)為是最佳洗滌溫度，但以5°C為增量降低溫度可以操縱洗滌條件的嚴(yán)密性。
6.洗滌步驟的次數(shù)：減少洗滌步驟的次數(shù)會降低雜交的嚴(yán)密性。但是，不建議進(jìn)行少于兩次的洗滌。
7.雜交混合物或制備的載玻片的儲存條件：如果雜交混合物或制備的載玻片未在黑暗中儲存或觀察前的儲存時間超過了建議的時長，則可能發(fā)生熒光降解。
8.探針沒有與所需的細(xì)菌細(xì)胞特異性雜交。上述降低雜交嚴(yán)密性的因素也可以調(diào)整，以產(chǎn)生更嚴(yán)密的雜交反應(yīng)。增加雜交和洗滌溫度以及洗滌步驟的次數(shù)，將增加探針雜交的特異性和洗滌的嚴(yán)密性。雜交溶液中甲酰胺的含量也可以增加（不超過40%），分別修改上述變量，以確定理想的雜交條件。
9.熒光信號過大或有光漂白現(xiàn)象。如果觀察到過量熒光或出現(xiàn)光漂白，應(yīng)考慮以下因素：1） 細(xì)胞密度：在雜交反應(yīng)中使用過多的細(xì)胞會使視場擁擠，難以觀察到個體細(xì)胞。2）制備的載玻片的存放：制備好的載玻片應(yīng)立即存放在黑暗中，直到觀察開始，并且在觀查過程中應(yīng)盡快拍攝圖像。
外顯子生物是一家專注于核酸探針的公司，如需技術(shù)支持或核酸探針等原位雜交耗材設(shè)備請聯(lián)系我們。我們竭誠為您服務(wù)。
