1. Xist探針準(zhǔn)備
（1）在 Xist 序列獲得寡核苷酸探針（20-40 核苷酸長(zhǎng)度的寡核苷酸，Tm=63-65ºC，標(biāo)記多個(gè)地高辛或熒光素），探針最終濃度約為12-25μM。亦可聯(lián)系我們制備和購(gòu)買探針，贈(zèng)送內(nèi)參。
（2）用雜交液將熒光或地高辛標(biāo)記的探針稀釋至終濃度為 250 nM 。雜交液配制：10%去離子甲酰胺，300mM NaCl；30mM檸檬酸鈉；1mg/ml牛血清白蛋白；10% DSS。亦可聯(lián)系我們購(gòu)買。
2.制備石蠟組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞：
石蠟組織切片：詳見石蠟組織切片mRNA原位雜交，類似于普通免疫組化切片。培養(yǎng)細(xì)胞：移去 6 孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基。用 PBS清洗，吸出，在培養(yǎng)皿中加入 0.5ml 胰蛋白酶，孵育5-10分鐘。加入5 ml 培養(yǎng)基，打數(shù)分散細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 10ml 管中，在室溫下以 1500 rpm 離心5 分鐘。棄去培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞于1-2 ml PBS中，細(xì)胞備用，福爾馬林或無水乙醇固定10分鐘。用細(xì)胞對(duì)切片進(jìn)行涂片或用設(shè)備甩片，37℃晾干，過夜。
3. 免疫熒光
（1）將載玻片放入裝有 PBSTT（1x PBS 含 0.1% Tween-20，0.1% Triton-100）的染色盒或染色缸內(nèi)中10分鐘。（2） 將載玻片傾斜放置，移去液體，滴加100 μl 封閉溶液（1x PBS、1% BSA、0.1% Tween-20），覆蓋玻片，在室溫下孵育 10 分鐘。（3）取下蓋玻片，倒去封閉液，加入 40-100μl 稀釋抗體（濃度為 1:500， 熒光抗體），注意避光。蓋好蓋玻片，室溫避光孵育30分鐘。
3. 原位雜交
（1）將載玻片傾斜，抗體緩沖液順玻片流下。在載玻片上加入 500 μl FISH 洗滌緩沖液（2x SSC+10% 甲酰胺），室溫孵育5分鐘。
（2）傾斜玻片，去除 FISH 洗滌液，載玻片上加入20μl 寡核苷酸探針，蓋上蓋玻片，然后將載玻片轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的濕盒內(nèi)；在37°C孵育 2-24 小時(shí)。
（3）玻片盒內(nèi)加入 FISH 洗滌液，將洗滌液預(yù)熱（如37°C水�。�，FISH 洗滌緩沖液。載玻片孵育5分鐘，期間，蓋玻片從載玻片上脫落。
（4）更換洗滌液，將載玻片洗滌緩沖液中繼續(xù)孵育 5 分鐘。
（5）將載玻片滴加 0.5 ng/ml 含抗淬滅劑DAPI溶液（我公司有售）。
（6）用指甲油或甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。4°C避光中保存幾個(gè)月。
