流式-原位核酸雜交（Flow-FISH）
流式技術(shù)被廣泛應(yīng)用，原位雜交也是70年代的技術(shù)。兩者結(jié)合可用培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮組織、污水細(xì)菌、淤泥、糞便，海水、植物等標(biāo)本，可以對(duì)細(xì)胞、革蘭氏陽、陰性細(xì)菌、環(huán)境細(xì)菌樣品進(jìn)行液體核酸雜交，接下來進(jìn)行FISH檢測(cè)或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)、甚至進(jìn)行流式分選技術(shù)。
通過把FISH技術(shù)與流式聯(lián)合應(yīng)用，即Flow-FISH，可檢測(cè)同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞微生物的核酸與抗體。Flow-FISH允許同時(shí)測(cè)量多個(gè)靶點(diǎn)。如亞菌株的分析或鑒定，用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞與不同的微生物作用機(jī)制。如研究細(xì)胞內(nèi)病原體-病毒、細(xì)菌群、真菌群的發(fā)病機(jī)理，相互作用，如EB、HIV-1、新冠病毒如何在細(xì)胞內(nèi)致病等規(guī)律。
（一）試劑：抗熒光衰減試劑(含DAPI)、乙醇（50%，85%，95%、100%，冷存，固定）、FISH固定液、FISH雜交液、細(xì)菌培養(yǎng)基、各種標(biāo)記的核苷酸探針、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）（pH 7.4）、20XSSC（0.1X，pH 7.0）。
（二）設(shè)備：鋁箔、蓋玻片、離心機(jī)、移液器、吸頭、顯微鏡、熒光顯微鏡（適當(dāng)濾光片）、透明指甲油或抗熒光封片劑、分光光度計(jì)、培養(yǎng)管、微型離心管、水浴鍋或雜交儀。
（三）培養(yǎng)的細(xì)胞
1.將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶，在指數(shù)最佳生長(zhǎng)時(shí)候，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察，將適當(dāng)細(xì)胞密度用于比較雜交�？梢约尤氩《�、真菌、細(xì)菌進(jìn)行相互作用的研究。
2.丟棄上清液，并將細(xì)胞用胰蛋白酶消化完全重新懸浮在1 ml的pH 7.4的1X PBS中。
3.以3,000 g離心5 min，丟棄上清液。
4.在500 µl 1X PBS（pH 7.4）中重新懸浮細(xì)胞。
5.加500 µl冷100%乙醇，將試管儲(chǔ)存在−20°C。固定細(xì)胞可在−20°C下儲(chǔ)存數(shù)月。
6.雜交之前，3000g，5 min使細(xì)胞顆�；瘲壣锨逡�，去除殘留乙醇。
（四）革蘭氏陽性細(xì)菌固定
1. 細(xì)菌培養(yǎng)物，接種2 ml肉湯培養(yǎng)物并在最佳生長(zhǎng)溫度、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)后，進(jìn)行OD600分光光度計(jì)讀數(shù)，將適當(dāng)細(xì)胞密度用于比較雜交。
2. 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600=0.4-1.0），以13,000 g離心5 min獲取細(xì)菌。在生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期收集的細(xì)胞將提供較好的信號(hào)。如果需要，使用較大規(guī)模培養(yǎng)，但小規(guī)模的培養(yǎng)物也能為FISH提供足夠的細(xì)胞數(shù)量。
3.丟棄上清液，并將細(xì)胞完全重新懸浮在1 ml的pH 7.4的1X PBS中。
4.以13,000 g離心5 min，丟棄上清液。
5.在500 µl 1X PBS（pH 7.4）中重新懸浮細(xì)胞。
6.加500 µl冷100%乙醇，將試管儲(chǔ)存在−20°C。固定細(xì)胞可在−20°C下儲(chǔ)存數(shù)月。
7.雜交之前，以13,000g，5 min使細(xì)胞顆�；瘲壣锨逡�。從細(xì)胞顆粒中去除殘留乙醇。
（五）革蘭氏陰性細(xì)菌固定
1.對(duì)于每個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)物，接種2 ml肉湯培養(yǎng)物，在培養(yǎng)基中以最佳生長(zhǎng)溫度培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)完成后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（或OD600分光光度計(jì)讀數(shù)），以合適細(xì)胞密度用于比較雜交。
2.將每種培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到2 ml微型離心管中，以13,000 g離心5 min。丟棄上清液。
3.在每管1 ml FISH用固定液中重新懸浮細(xì)胞顆粒，并在室溫下培養(yǎng)3 h。
4.以13,000g離心細(xì)胞混合物5 min并丟棄上清液。
5.通過50%乙醇重新懸浮并在室溫下孵育5 min，洗滌細(xì)菌。
6.以13,000 g離心試管2 min，丟棄上清液。
7.用80%和95%的乙醇重復(fù)步驟12-13。
8.將試管置于真空干燥機(jī)中干燥細(xì)胞顆粒10 min。固定后可在4°C下儲(chǔ)存1個(gè)月。
（六）環(huán)境水樣、空氣、污泥等固定
對(duì)于環(huán)境樣品，有必要包括未與標(biāo)記探針孵育的樣品，以評(píng)估樣本的自發(fā)熒光。
1.盡可能使環(huán)境樣品均勻化，減少聚集對(duì)獲得探針可接近的單細(xì)胞懸浮液的不利影響。在雜交之前通過離心分離細(xì)胞或洗滌環(huán)境樣品。
2.不同細(xì)菌類別，選擇不同固定方案。環(huán)境樣品很可能含有革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌的混合物，有必要對(duì)革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌在雜交之前，可用兩次不同方法固定。
（七）預(yù)雜交與雜交。
1.將固定細(xì)胞重新懸浮在500 µl FISH雜交溶液中，在37°C下培養(yǎng)30 min。完成后移除一份與預(yù)雜交混合物的（如50 µl）進(jìn)行雜交。每個(gè)樣品都能進(jìn)行多次雜交，減少每個(gè)反應(yīng)所需的探針。
2.混合物中加入熒光標(biāo)記核苷酸探針。
探針濃度應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)決定。幾個(gè)因素可影響所需探針數(shù)量：探針靈敏度、樣品密度和雜交時(shí)間。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，將5 µl 100 ng/µl探針加到50 µl預(yù)雜交液,中可產(chǎn)生一致且均勻的熒光。
3.在37°C至65°C避光處雜交或用鋁箔覆蓋試管孵育2-3 h。如使用多個(gè)探針，建議65℃下進(jìn)行雜交。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)42°C，改變甲酰胺濃度，可以達(dá)到所需的雜交效果。
4.以13,000 g離心混合物5 min并丟棄上清液。
5.通過在20 µl 0.1X SSC中重新懸浮細(xì)胞顆粒以清洗細(xì)胞，37°C的黑暗中培養(yǎng)15 min。
6.以13,000 g離心混合物5 min并丟棄上清液。
7.重復(fù)步驟22-23兩次。
8.在20 µl 0.1X SSC中重新懸浮洗滌過的細(xì)胞顆粒。
9.在載玻片上制備樣品：
i. 將10 µl樣品轉(zhuǎn)移到用乙醇清洗過的顯微鏡載玻片上。
iv. 儲(chǔ)存載玻片于黑暗中。在觀察前可在4°C的黑暗中保存至多1 周。
10.通過流式檢測(cè)，選擇正確的流式激光的通道。
（七）實(shí)驗(yàn)問題：
1. 雜交溫度：更低的溫度會(huì)導(dǎo)致探針雜交增加，但也會(huì)降低特異性。
2.去離子甲酰胺濃度：可能需要低濃度的甲酰胺。一般情況下，0%-40%的甲酰胺尋找合適的范圍濃度。
3.探針設(shè)計(jì)和濃度：探針設(shè)計(jì)自行設(shè)計(jì)標(biāo)記或者聯(lián)系我們，摩爾濃度0.5-5μM比較恰當(dāng)，可能需要探針標(biāo)記方法和探針的長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)整，長(zhǎng)片段的探針可以稀釋，短的濃度高一些。
4.洗滌步驟中使用的SSC濃度：使用1X SSC代替0.1X SSC將降低洗滌步驟的嚴(yán)密性。
5.洗滌溫度：37°C通常被認(rèn)為是最佳洗滌溫度，5°C為增量或降低溫度調(diào)整洗滌條件。
6.洗滌步驟的次數(shù)：減少洗滌步驟的次數(shù)會(huì)降低雜交的嚴(yán)密性。不建議少于兩次的洗滌。
7.雜交混合物或制備的載玻片的儲(chǔ)存條件：如果雜交混合物或制備的載玻片未在黑暗中儲(chǔ)存或觀察前的儲(chǔ)存時(shí)間超過了建議的時(shí)長(zhǎng)，則可能發(fā)生熒光降解。
8.探針沒有與所需的細(xì)菌細(xì)胞特異性雜交。上述降低雜交嚴(yán)密性的因素可以調(diào)整，用嚴(yán)密的雜交反應(yīng)。增加雜交和洗滌溫度及洗滌步驟次數(shù)，將增加探針雜交的特異性和洗滌的嚴(yán)密性。雜交溶液的甲酰胺含量可以增加（不超過40%），調(diào)整，以確定理想雜交條件。
9.熒光信號(hào)過大或有光漂白現(xiàn)象。如果觀察到過量熒光或出現(xiàn)光漂白，應(yīng)考慮以下因素：1）細(xì)胞密度：在雜交反應(yīng)中使用過多的細(xì)胞會(huì)使視場(chǎng)擁擠，難以觀察到個(gè)體細(xì)胞。2）制備的載玻片的存放：制備好的載玻片應(yīng)立即存放暗處，在觀察中盡快拍圖。
10.流式FISH的最大問題之一在于流式分析的設(shè)門，要考慮病毒、細(xì)胞、真菌的大小。
