(1)收集:染色體以 50g離心力 離心 3 分鐘,將含有染色體的上清液轉(zhuǎn)移到干凈離心管中。再次將染色體懸浮液以 50g離心力 再離心 3 分鐘,上清液移入新的離心管中,主要除去染色體提取物中存在的大部分細(xì)胞核和細(xì)胞碎片。
(2)純化染色體:將懸浮液利用針頭吸入 3或5ml注射器。然后穿過(guò)無(wú)菌尼龍網(wǎng),分離和提取的染色體(外顯子生物,貨號(hào):001.503),用 DNA 結(jié)合染料(如 DAPI)來(lái)確定,熒光下觀察以確定該等分試樣中的染色體數(shù)量。
(3)將上述尼龍網(wǎng)用0.9%氯化鈉溶解,制成106 條染色體/ml 樣品的染色體懸浮液,在1 ml 的緩沖液中稀釋?zhuān)⑼ㄟ^(guò)加入 20 滴 3:1 甲醇:乙酸固定液,輕輕旋轉(zhuǎn)懸浮液進(jìn)行固定。然后將染色體以 350g 離心 10 分鐘,去除上清液。將 1 ml 體積的相同固定劑添加到輕彈的沉淀中,在室溫下孵育 30 分鐘。在相同條件下離心后,除去上清液,加入1ml新鮮固定液。
(4)離心去除上清液后,將染色體沉淀重懸于 160 μl 預(yù)熱的雜交緩沖液(40% 去離子甲酰胺、4×SSC、2×Denhardt 溶液,外顯子生物,001.504)中。將體積為 2.5 μl 的用所需要的生物素染色體探針78℃預(yù)熱5分鐘, 添加到染色體懸浮液中,將整個(gè)混合物在 73°C 下變性 3.5 分鐘。然后將其在冰上保持 5 分鐘,在 37°C 振蕩中孵育 2 0 小時(shí)左右。
(5)離心和重懸,在 500 μl 預(yù)熱的 0.1×SSC 中獲得標(biāo)記的染色體。將染色體離心并將沉淀物重新懸浮在 2×SSC 中。將 15 μl 的等分試樣用 DAPI 染色以確保染色體存在。
(6)將親和素磁珠與 1×106 探針結(jié)合的染色體懸浮在 100 μl 緩沖液中,該緩沖液含有 0.05% (v/v) 吐溫 20 和 5% (v/v) 脫脂干牛奶。懸浮液在 37°C 振蕩水浴中孵育 2 小時(shí)。然后將懸浮液轉(zhuǎn)移到方形比色皿中,通過(guò)將比色皿的一側(cè)暴露于條形磁鐵來(lái)收集珠結(jié)合部分。通過(guò)將等體積的樣品和預(yù)熱的 2.0 M 羥胺·HCl 溶液(pH 8.5)在 37°C 下攪拌 4 小時(shí)來(lái)切割珠子。
(7)裂解的磁珠可以通過(guò)暴露在磁場(chǎng)中來(lái)收集。也可以通過(guò)以 350g 離心樣品并吸出上清液收集含有染色體的離心沉淀來(lái)去除過(guò)量的成份。
(8)將分離的染色展在顯微載玻片上,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。